Niedawne doniesienia wskazują na obecność nowych mutacji genu receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) w małych próbkach DNA wyekstrahowanego z fragmentów zatopionych w parafinie lub próbek mikrosadzonych laserem.1,2 Nagahara i wsp .1 opisali mutacje EGFR w raku okrężnicy . Mutacje te były nowymi przejściami G . A lub A . G. Podobnie, Tsao i in. (Wydanie z 14 lipca) 2 donoszą, że 24 (53 procent) mutacji, które znaleźli w próbkach niedrobnokomórkowego raka płuc były nowymi wariantami mutacji; 22 (92 procent) z tych mutacji to przejścia C . T / G . A lub A . G / T . C. Mutacje te nie zostały wcześniej zgłoszone w ponad 2000 analizach mutacji EGFR przeprowadzonych na DNA wyekstrahowanym z fragmentów zamrożonych guzów.
Poprzez sekwencjonowanie wielu produktów amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (10 na próbkę) z 70 próbek DNA nowotworu płuc wyekstrahowanego z pojedynczej (5 .m) sekcji zatopionej w parafinie, odkryliśmy 45 niezbyt częstych mutacji w eksonach od 18 do 21 gen EGFR, w tym 22 przejścia zgłoszone przez Tsao et al. oraz 4 mutacje zgłoszone przez Nagahara i in. Wszystkie wykryte nietypowe mutacje zostały uznane za artefakty. Rzeczywiście, mutacje znaleziono również w wielokrotnych amplifikacjach próbek DNA zatopionych w parafinie z 50 prawidłowych tkanek (węzłów chłonnych) uzyskanych od 50 pacjentów, którzy nie mieli nowotworów; mutacje zidentyfikowano w mniejszości amplifikacji z tej samej próbki; i zapobiegano mutacjom C . T / G . A przez dodanie genu Uracyl-N-glikozylazy do matrycy DNA przed amplifikacją PCR.
Artefakty, które obserwowaliśmy, można przypisać do pośmiertnej deaminacji cytozyny lub adeniny, co prowadzi do odpowiednio reszty uracylu lub hipoksantyny. Gdy DNA zawierający takie zmiany jest używany jako matryca do PCR, C . T / G . A lub A . G / Powstaną przejścia T . C. C . T / G . Mutacjom można zapobiec poprzez traktowanie matrycy N-glikozylazą uracylu, która usuwa uracyl z DNA, tworząc przerwę pasma. Mutacje artefaktyczne zostały opisane przez kilku autorów, 3-5 i opisano również alternatywne wyjaśnienia
Rysunek 1. Rysunek 1. Sekwencje wielokrotnych amplifikacji PCR małych ilości (5 ng) DNA ekstrahowanego z tkanek zatopionych w parafinie. Kropki wskazują, że sekwencja jest identyczna z sekwencją konsensusową egzonu 19 EGFR, pokazaną na górze paneli. Liczby odpowiadają liczbie amplifikacji. Panel A pokazuje DNA z guza płuca, w którym występuje pięć różnych mutacji w czterech niezależnych amplifikacjach. Panel B pokazuje DNA z prawidłowej tkanki (węzeł chłonny), w którym występuje sześć różnych mutacji w pięciu niezależnych amplifikacjach. Wiele mutacji można zobaczyć w tej samej próbce DNA, a czasami w tej samej amplifikacji (np. Amplifikacja 3 w panelu A i amplifikacje 6 i 9 w panelu B); ponadto tylko jedna lub kilka amplifikacji z pojedynczej próbki DNA wykazuje tę samą mutację, co wskazuje, że zmiany zasad występują w podgrupach cząsteczek DNA. Zasady zamknięte w prostokątach odpowiadają zmianom, o których donieśli Nagahara i wsp.1, oraz Tsao i wsp.2 jako nowatorskie mutacje. PCR oznacza reakcję łańcuchową polimerazy i receptor naskórkowego czynnika wzrostu EGFR.
Te artefakty można łatwo zaobserwować, przeprowadzając wielokrotne amplifikacje PCR bardzo małych ilości DNA, szczególnie jeśli DNA jest izolowany z tkanek zatopionych w parafinie3-5 (Figura 1) Przy użyciu niskiej liczby kopii DNA, amplifikacja PCR rozpoczyna się od pojedynczego lub kilku matryc, umożliwiając wykrycie zmian obecnych w podzbiorach cząsteczek DNA, które w innym przypadku są niewykrywalne.4
Ponieważ mutacje EGFR można stosować jako wskazówki w leczeniu klinicznym raka płuc, należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z niewielkimi ilościami DNA, szczególnie jeśli próbki zostały wyekstrahowane z parafiny. Występowaniu artefaktów można zapobiec przy użyciu większych ilości matrycowego DNA (co najmniej .g DNA odzyskanego z parafiny). Jeśli konieczne jest użycie bardzo niewielu kopii cząsteczek matrycy, tak jak w przypadku DNA uzyskanego z przekrojów mikroskopowych, konieczne jest zbadanie wielu amplifikacji.
Antonio Marchetti, MD
Lara Felicioni, MD
Fiamma Buttitta, MD
Center for Excellence on Aging, 66013 Chieti, Włochy
[email protected] to
5 Referencje1. Nagahara H, Mimori K, Ohta M, i in. Mutacje somatyczne receptora naskórkowego czynnika wzrostu w raku jelita grubego. Clin Cancer Res 2005; 11: 1368-1371
Crossref Web of Science MedlineGoogle Scholar
2. Tsao MS, Sakurada A, Cutz JC, i in. Erlotynib w raku płuc – molekularne i kliniczne predyktory wyniku. N Engl J Med 2005; 353: 133-144
Full Text Web of Science MedlineGoogle Scholar
3. Hofreiter M, Jaenicke V, Serre D, Haeseler Av A, Paabo S. Sekwencje DNA z wielu amplifikacji ujawniają artefakty wywołane deaminacją cytozyną w starożytnym DNA. Nucleic Acids Res 2001; 29: 4793-4799
Crossref Web of Science MedlineGoogle Scholar
4. Akbari M, Hansen MD, Halgunset J, Skorpen F, Krokan HE. Mała liczba kopii szablonu DNA może powodować podatność na reakcję łańcuchową polimerazy w sposób zależny od sekwencji. J Mol Diagn 2005; 7: 36-39
Crossref Web of Science MedlineGoogle Scholar
5. Williams C, Ponten F, Moberg C, i in. Wysoka częstotliwość zmian sekwencji jest spowodowana utrwaleniem formaliny próbek archiwalnych. Am J Pathol 1999; 155: 1467-1471
Crossref Web of Science MedlineGoogle Scholar
Odpowiedź
Rysunek 1. Rysunek 1. Prognozy przeżycia Kaplan-Meier. Panel A pokazuje wyniki dla pacjentów z delecjami egzonu 19 lub mutacji L858R eksonów 21, a panel B pokazuje wyniki dla pacjentów z EGFR typu dzikiego lub innych mutacji o nieokreślonej istotności. Wartości P zostały obliczone przy użyciu testu log-rank. CI oznacza przedział ufności.
Autorzy odpowiadają: Marchetti i in. podkreśliły trudności w przeprowadzeniu analizy mutacji EGFR na małych, utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie próbkach biopsyjnych, które zwykle są jedynymi próbkami dostępnymi od pacjentów z zaawansowanym rakiem płuc i są niewystarczające, aby umożliwić powtórzenie oznaczeń. Niedawno zakończyliśmy testy mutacyjne na 45 dodatkowych próbkach z próby BR.21 i z powodzeniem uzyskaliśmy wyniki dla eksonów 19 i 21 w 25 próbkach (wskaźnik sukcesu, 56 procent). Wśród wyników znaleźliśmy cztery nowe przypadki z delecjami egzonów 19 lub mutacjami L858R eksonów 21. Biorąc pod uwagę niepewność związaną z tożsamością lub funkcjonalnym znaczeniem nowych mutacji, ponownie przeanalizowaliśmy nasze dane, koncentrując się jedynie na delecji egzonu 19 i mutacjach egzonu 21 L858R, dla których znaczenie funkcjonalne jest jaśniejsze. Uwzględniając nowe próbki, 24 przypadki, które można było ocenić, zawierały te klasyczne mutacje wśród 201 pacjentów z częstością występowania wynoszącą 11,9 procent, która jest podobna do częstości mutacji zgłaszanych przez innych badaczy. Wśród pacj
[więcej w: olej z pestek arbuza, badanie krwi kreatynina cena, pierwsza pomoc algorytm ]
[podobne: darmowe leki dla seniora, pierwsza pomoc algorytm, badanie krwi kreatynina cena ]
